OBJETIVOS PRINCIPALES: 1) Analizar funcionalmente las mutaciones de los genes candidato GPATCH3, LRP2 y GUCA1C, identificadas previamente por nuestro grupo en el estudio del exoma de 26 pacientes con glaucoma congénito primario grave. 2) Estudiar en larvas de pez cebra los fenotipos oculares resultantes de reducir o incrementar la expresión de los genes ortólogos de los 3 genes mencionados anteriormente. 3) Analizar la presencia de mutaciones de los genes candidato LRP2 y GUCA1C en 90 pacientes con glaucoma congénito sin mutaciones conocidas. 4) Identificar nuevos genes implicados en la enfermedad mediante reanálisis de 23 de los exomas ya secuenciados, siguiendo una estrategia de análisis de tríos formados por el probando y sus progenitores sanos. METODOLOGÍA: Objetivo 1) Las mutaciones identificadas se generarán mediante mutagénesis dirigida. Posteriormente serán expresadas en células HEK-293T y se analizará su estabilidad, localización subcelular y transactivación, mediante western blot, inmunocitoquímica y ensayos con luciferasa, respectivamente. Objetivo 2) Se estudiará en larvas de pez cebra la expresión de los genes ortólogos de los 3 genes candidato, utilizando hibridación in situ fluorescente y microscopía confocal. También se analizará mediante microscopía confocal el fenotipo ocular después de inhibir la expresión de estos genes ortólogos (knockdown con morfolinos) y de sobreexpresarlos transitoriamente (microinyección de ARNm). Objetivo 3) El rastreo en 90 pacientes de mutaciones de los genes LRP2 y GUCA1C se realizará mediante secuenciación masiva (targeted sequencing). Objetivo 4) Para el estudio de los 23 exomas en tríos se determinará la secuencia del exoma de los progenitores mediante secuenciación masiva. Se aplicarán distintos filtros para identificar las variantes candidatas y se realizarán estudios funcionales para confirmar su patogenicidad.

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Acción Estratégica en Salud (AES)