Los objetivos de este proyecto son: 1) desarrollar y validar protocolos reproducibles para la detección del cccDNA, 2) analizar los niveles de cccDNA durante las diferentes etapas de la historia natural de la hepatitis crónica B y su correlación con los parámetros clínicos y virológicos, 3) establecer de un sistema de cultivo celular basado en un bioreactor microfluídico para estudio de infección del VHB in vitro, y 4) analizar el impacto de la variabilidad genética del VHB en las regiones diana de nuevos antivirales (no NUCs) utilizando el sistema de cultivo microfluídico. Metodología: La determinación del cccDNA y los intermediarios de replicación se realizará por qPCR, comparando diversos tratamientos enzimáticos previos. Una vez optimizado el método, se analizará la persistencia de cccDNA en muestras de pacientes (biopsias hepáticas). Se realizarán ensayos de infección in vitro utilizando los modelos convencionales y un dispositivo microfluídico que simula el microambiente hepático. Para ello se infectarán hepatocitos primarios (mono y cocultivo con células endoteliales sinusoidales hepáticas) o líneas celulares HepG2-hNTCP o HepaRG con suero de pacientes con hepatitis crónica B o virus producido en cultivo celular (± nuevos antivirales directos, no NUCs). Se analizarán los intermediarios de la replicación del VHB por qPCR (cccDNA, ADN-VHB total, rcDNA y pgRNA), la expresión de antígenos virales y la producción de partículas infecciosas. El genotipo del VHB y la composición de la cuasiespecies se analizarán por secuenciación masiva.

hepatitis crónica B
VHB
ADN circular cerrado covalentemente
ADNccc
cccDNA
cultivo celular
terapia antiviral

Acción Estratégica en Salud (AES)