Objetivos: Una elevada proporción de las variantes de ADN detectadas en genes de susceptibilidad de cáncer de mama hereditario (CMH) son de significado clínico desconocido. Por otro lado, la desregulación del splicing es un mecanismo etiopatogénico prevalente en genes CMH. Nuestro objetivo final es la clasificación funcional mediante ensayos de splicing en minigenes híbridos de las variantes genéticas candidatas de un panel de más de 30 genes CMH detectadas en 30.000 pacientes. Este estudio aportará datos esenciales para su clasificación clínica y el establecimiento del riesgo asociado a dichas variantes. Asimismo contribuirá a la elucidación del espectro de predisposición genética a cáncer de mama hereditario, y el papel del splicing aberrante como mecanismo etiopatogénico en esta enfermedad. Objetivos concretos: 1) selección bioinformática de variantes; 2) construcción y validación de minigenes ad hoc de exones de genes CMH; 3) Identificación de mutaciones con impacto en el splicing;4) Regulación e implicación en la enfermedad de exones con donador atípico GC de genes CMH (BRCA2, PALB2, RAD50) y otros de la ruta de reparación de ADN;5) Evaluación global: papel del splicing anómalo en CMH, optimización de los test genéticos de diagnóstico y estimación personalizada de riesgo., Métodos: Las variantes candidatas serán seleccionadas con NNSplice y HSF. Se diseñarán los minigenes con los exones de interés y los insertos se generarán mediante síntesis génica/PCR alta fidelidad y las variantes se introducirán mediante mutagénesis dirigida. Los constructos wild type y mutantes se ensayarán funcionalmente en líneas celulares humanas, y los transcritos anómalos inducidos serán caracterizados mediante secuenciación y análisis de fragmentos. El mapeo funcional de splicing enhancers de los exones GC se realizará mediante microdeleciones exónicas, inhibición de factores de splicing con siRNAs e identificación de los factores de splicing implicados mediante ensayos de pull-down.

cáncer de mama
gen de susceptibilidad
BRCA1
BRCA2
PALB2
mutación
splicing
corte y empalme
minigen híbrido
variante no clasificada