OBJETIVOS: El CADASIL es una enfermedad genética cerebrovascular grave causada por una mutación en el gen que codifica para el receptor NOTCH3, y que afecta principalmente a las arterias cerebrales provocando infartos cerebrales, migrañas y demencias. El receptor NOTCH3 contiene 34 dominios en tándem tipo EGF (epidermal growth factor). Las mutaciones en el gen causan una alteración alguno de este estos dominios lo que genera que la proteína NOTCH3 no se puede degradar, acumulándose y alterando la funcionalidad de las células musculares y endoteliales que componen las arterias. Estudios recientes han demostrado que las mutaciones que afectan a los dominios EGF en las regiones comprendidas entre 7-34 presentan una sintomatología leve o asintomática, mientras que aquellas que afectan a las regiones 1-6 EGF los síntomas son mucho más graves, posiblemente debido que a que los procesos moleculares relacionados de la enfermedad son mas activos. En este proyecto proponemos generar un modelo de CADASIL utilizando células madre pluripotentes inducidas (iPSC) mediante la reprogramación de células de pacientes con fenotipo leve y grave para recapitular ambas condiciones fenotípicas y poder determinar los mecanismos moleculares que causan la alteración de las células musculares y endoteliales. También nos proponemos corregir la mutación del gen NOTCH3 para validar los mecanismos moleculares relacionados con esta patología. METODOLOGÍA: las iPSCs de pacientes CADASIL (fenotipo leve y severo) y sujetos de control se generarán a partir de células humanas de sangre usando el virus Senday no integrativo que contiene los cuatro factores de reprogramación. El protocolo de diferenciación de iPSCs a células de músculo liso se hará utilizando combinación de factores PDFGB y TFGß y los factores CHIR, FGF2, BMP4 y VEGF para generar las células endoteliales. La tecnología molecular basada en Crispr-Cas9 será utilizada para corregir la mutación NOTCH3 en las células del paciente.

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